流式細胞術的基本理論

1. 工作原理 流式細胞儀主要由流動室及液流系統、激光器及光學系統、光電管及檢測系統、計算機及分析系統四個部分組成，見圖18-1。

待測細胞被制備成單細胞懸液，經特異性熒光染料染色后置于樣品管中，在氣體壓力推動下被壓入流動室，流動室內充滿鞘液（不含細胞或微粒的緩沖液），在高壓作用下從鞘液管噴出包裹細胞，使細胞排成單列形成細胞液柱，依次通過檢測區。液柱與高度聚焦的激光束垂直相交，被熒光染料染色的細胞受到激光激發產生熒光信號和散射光信號，這些光信號通過波長選擇的濾光片，由相應的光電管和電子檢測器接收并轉換成電信號，經放大器放大后送入計算機并進行分析顯示和結果輸出。

帶有細胞分選功能的流式細胞儀對細胞的分選是由分選器來完成。待分選的細胞在形成液滴時被充以特定的電荷，并通過超高頻的壓電晶體產生高頻振蕩，使液柱斷裂成均勻的液滴，帶有電荷的液滴向下落入偏轉板的高壓靜電場時，按照所帶電荷發生偏轉，落入的收集器內，完成分類收集的目的。

2. 光學原理　流式細胞儀的光學系統由激光器和若干組透鏡、濾光片等光學元件及光學通路組成，細胞帶有的特異熒光染色經激光器的激發，通過不同的光學元件將不同波長的熒光信號送入到相應的電子探測器。

流式細胞儀的激光器以氬離子激光器常見，光學元件主要是分色反射鏡（DL）和濾光片（Filter），它們主要分為三類：長通濾片（long-pass filter，LP）、短通濾片（short-pass filter，SP）和帶通濾片（band- pass filter，BP）。

（1） 分色反射鏡（488DL、 550DL、 600DL、640DL）：用于選擇被測熒光波長，只允許大于特定波長的光通過，而將小于特定波長的光反射到光電檢測器。

（2） 長通濾片：只允許特定波長以上的光通過，特定波長以下的光不能通過。如LP620nm濾片，只允許620nm以上的光通過，而620nm以下的光被吸收或返回。

（3） 短通濾片：與長通濾片相反，允許特定波長以下的光通過，而特定波長以上的光被吸收或返回。

（4） 帶通濾片（488BP、525BP、575BP、675BP）： 允許某一特定波長的光線通過，而其他波長的光全部被阻斷。

例如，FITC染料發射出525nm的綠色熒光，PE染料發射出575nm的橙色熒光，分別選擇550DL和525BP組成的濾片組和600DL和575BP濾片組，即可達到特異地接收FITC和PE熒光信號的目的。光電倍增管和硅光電二極管，可分別將側向散射光和前向散射光以及525～675等不同的熒光信號收集檢測。

3. 參數測量　流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。

（1）散射光測量：細胞在通過測量區時由于受光照射會向空間360°立體角的所有方向散射光線，散射的信號與細胞的大小、形狀、質膜和細胞內部的折射率有關，與收集散射光的方向也有關。在流式細胞術中一般采用0°前向散射光（forward scatter, FS）和90°側向散射光（side scatter，SS）。前向散射光的強度與細胞大小有關，對于同一個細胞群體，散射光強的細胞大一些；而散射光弱的細胞小一些。側向散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，對胞質內較大的顆粒也有反應，可獲得有關細胞內部精細結構和顆粒性質及膜表面光滑程度的有關信息。圖18-2是利用流式細胞儀前向散射光和側向散射光測得的全血白細胞二維點圖，由圖中可見，利用FS和SS可將白細胞群中不同細胞群分開，得到很清楚的三群細胞。

（2）熒光測量：熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發出的熒光。細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強。②特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光。用流式細胞儀測定細胞的特征熒光時，自發熒光對所測定特征熒光是一種本底信號，應設定陰性對照樣品加以去除，同時應盡可能地通過選用較亮的熒光染料染色細胞、選用適宜的激光和濾片光學系統、采用電子補償電路等方法提高信號/噪聲比，以減少自發熒光的干擾，這是在樣品處理與測量中應特別注意的問題。

熒光補償：對于雙標記或三標記熒光染色的樣品，在應用FCM測量時需要對熒光信號的光譜重疊部分進行校正，特別是在實際測量中當兩波長比較接近，如FITC發射的525nm熒光和PE發射的575nm熒光會發生交叉干擾，而使被測信號失真，測量結果產生較大的誤差，因此需采用熒光補償方法來解決這種交叉重疊的問題。目前生產廠家都提供有熒光補償的實用程序，用廠商的488nm激光激發的三種熒光染料（FITC、PE、PerCP），在測量中加以正確補償即可比較容易達到正確測量熒光信號的目的。

4. 測量參數分析　流式細胞儀的數據顯示方式包括單參數直方圖（histogram）、二維點圖（dot plot）、二維等高圖（contour）、假三維圖（pseudo 3D）等。

（1）單參數直方圖：是流式細胞術使用zui多的一種分析方法，它主要用來分析細胞相對數與測量參數之間的關系（圖18-3）。只能顯示一個參數與細胞之間的關系是它的局限性。

（2）二維點圖：二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系。橫坐標和縱坐標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應坐標值的細胞存在。但對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結構（圖18-4）。

（3）等高線圖和密度圖：可以同時表達檢測參量和細胞頻度，等高線圖是將代表相同細胞數目的點依次連接起來形成密閉的曲線，越在里面的曲線代表的細胞數目越多（圖18-5）；密度圖則依據細胞分布的密度大小，細胞密度大的地方點的密度大，使數據的顯示更直觀。

（4）假三維圖：利用計算機技術將原二維圖中的隱坐標-細胞數同時顯現，能多方位地觀察“山峰”和“谷地”的結構和細節，更為直觀，有助于對數據進行分析。

5. 使用流式細胞儀注意事項

（1）光電倍增管要求穩定的工作條件，暴露于較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽。

（2）使用光源必須預熱并注意冷卻系統工作是否正常，光源不得在短時間內（一般1h左右）反復開關。

（3）液流系統必須隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘液使用前要經過過濾、消毒。

（4）注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類型等。

（5）每次測量都需要設立對照組。