動植物樣品的采集及DNA樣品的提取（上）

1.動物樣品的采集及處理方法 
       遺傳學(xué)數(shù)據(jù)在野生動物和圈養(yǎng)動物的保護和管理中變得日益重要。在本文中，我們總結(jié)了一些能簡便而有效地獲得樣品及數(shù)據(jù)的方法。 
       我們在采集樣品之前，對將要進行的遺傳學(xué)分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，當(dāng)采集地與實驗室有相當(dāng)距離時，采集者常常要保存好樣品直到有合適的接受者或存放地，這就要求采集者應(yīng)具備一定的經(jīng)驗。 
       首先，所有樣品均應(yīng)以個體序號進行標(biāo)注，并且應(yīng)寫上種名、性別、采樣者姓名以及采集日期，越詳盡越好，以便同一個體的不同類數(shù)據(jù)可以相互引用，另外，地理來源的標(biāo)注也很重要，需要注明。對于野外捕獲的動物，有條件者在地圖上標(biāo)明捕獲地及其經(jīng)緯度。對圈養(yǎng)動物的每個野外捕獲種源都要有同樣的記錄和詳盡的譜系圖，因為譜系圖可用于計算近交系數(shù)。 
       總之，背景資料越詳細(xì)越好，即使不能得到這里所列的全部信息，也要盡可能詳盡。 
 
 
1．1 樣品的測量方法 
在一定數(shù)量的分類群中采用的標(biāo)準(zhǔn)測量方法可用于以下四個方面： 
（1）分類學(xué)上：一套理想的測量方法應(yīng)能大致上重建機體每個主要硬件部分的形狀和大小。 
（2）不對稱性分析：機體各部分的起伏不對稱，也許表明進化過程在一定程度上正在變得不穩(wěn)定，這可能是環(huán)境壓力或近交的結(jié)果。測量不對稱時機體左右兩部分均應(yīng)考慮在內(nèi)。 
（3）遺傳變異：在科級水平上，如果對同一年齡的個體采用同樣的測量方法，就有可能對所選特征中的遺傳成分變異進行粗略的估計。雖然并非總是能做到這樣，但能使遺傳學(xué)家對所選特征（如生殖特征方面遺傳變異的任何丟失）進行監(jiān)視。 
（4）生理檢測或記錄：采用標(biāo)準(zhǔn)測量方法得到的記錄，也許會有助于與用其他手段得到的數(shù)據(jù)起來分析。例如，如果有了形態(tài)的記錄，或是特殊寄生物的感染記錄，遺傳學(xué)家就能因此尋找在不同群體中這些因素與變異水平的相關(guān)性。 
 
 
1．2 組織樣品的采集和保存 
    下面詳細(xì)給出針對不同研究目的的適當(dāng)方法。當(dāng)然，每個實驗室都有各自習(xí)慣的組織處理方法，因此，本文僅給出快速保存的有關(guān)要求，但對每種組織的可用性都有所評述，以便在用途有沖突時，能對潛在數(shù)據(jù)的可能應(yīng)用作出迅速判斷。  
 
    使用腫瘤、毛發(fā)及樣品，保存時應(yīng)特別注意。使用細(xì)胞培養(yǎng)樣品可減少對活體或新殺動物的依賴，如果培養(yǎng)物來源于腫瘤組織細(xì)胞，則可大量減少對同種動物組織的進一步需求。組織材料必須在數(shù)小時內(nèi)送到有關(guān)實驗室或用于其他的細(xì)胞培養(yǎng)。如果已經(jīng)知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技術(shù)從很少一部分組織中擴增DNA，從而使極其的樣品（如一根毛發(fā)或單個）具有更高的利用價值和更大的可信度。 
組織必須取自活體動物或死后1～2 分鐘內(nèi)的動物，并且要快速保存起來，除非出現(xiàn)下述情況：在野外條件或是匆忙安排的活體取樣，因此沒有時間同實驗室。此時要有目的地擴大采集和儲存量。如果已經(jīng)詳細(xì)知道樣品的確切用途，則有時條件可以放寬。例如，對血液樣品來說，有些酶是不要求立即凍存的。快速凍存時樣品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。凍存樣品可在—70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和運輸。樣品凍存及運輸均以放入液氮中效果較好。非凍結(jié)冰箱是不能用的。 
 
1．2．l 用于染色體研究的軟組織的處理 
    室溫下將全部或部分樣品浸入0．9％的生理鹽水中，在數(shù)分鐘內(nèi)將樣品送至實驗室，zui遲也要在1～2 小時之內(nèi)送到。 
    研究染色體能看到有絲分裂和減數(shù)分裂，從而了解有關(guān)染色體倒位等現(xiàn)象。染色體倒位會影響到受精和遺傳重組，可能的同性個體應(yīng)從染色體方面進行檢查，但對哺乳動物來說，通常不需要研究同性別的染色體。 
 
 
1．2．2 用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的組織的處理 
    通常來源于幼體動物的組織用于細(xì)胞培養(yǎng)較好。在一個個體中，癌組織和肺組織是的，但其他軟組織也可以用。 
    細(xì)胞培養(yǎng)常用的是新鮮組織，但捕殺幾天后的動物組織仍能用來培養(yǎng)。總之，樣品越快到實驗室，成功的可能性就越大。 
    如果取樣時需切開活體動物的皮膚，則應(yīng)當(dāng)在無菌的條件下進行。對細(xì)胞培養(yǎng)來說，無  
菌條件下進行進一步的處理也是很有必要的，而在野外這是難以做到的。因此，一個不透風(fēng)的封閉空間以及面具、手套是很有用的，至少操作人員應(yīng)離開工作臺面遠(yuǎn)一些。所有的臺面、試劑瓶、手套、儀器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的試劑應(yīng)是新鮮的，如果對其無菌性有任何懷疑（如變渾濁或變顏色）就應(yīng)倒掉。 
在無菌條件下將組織樣品放入0％的酒精中，搖動1 分鐘后，將樣品轉(zhuǎn)人收集液中，在室溫下放置1～4 天。如需放置更長時間，則兩天后須將組織樣品轉(zhuǎn)到運輸液中，就可再于室溫下存放幾天。轉(zhuǎn)移過程中無菌操作是很重要的，因為運輸液中一般不使用防腐劑。 
    收集液和運輸液一般由接受樣品的實驗室提供。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)可生產(chǎn)出更多的材料而不必再從動物中取，達到事半功倍的效果。 
 
 
1．2．3 用于染色體研究的血樣的采集 
    采血樣須無菌操作。采血用的注射器、小瓶等應(yīng)用肝素潤濕。有些用品買來時就已經(jīng)用肝素處理過。迅速將血樣送往實驗室（在低溫條件下但不使其凍結(jié)）。如果條件不允許，可在無菌條件下，每 0．lml 血樣加 5ml 的血樣處理液，然后在室溫下轉(zhuǎn)送到實驗室（實驗室會有另一種準(zhǔn)備好的處理液）。 
 
1．2．4 用于酶及其他蛋白質(zhì)研究的軟組織的處理 
    將軟組織切成1cm 見方的小塊，包好并迅速凍存。如將組織塊浸泡在2％的苯甲醛中，在室溫下放置，某些酶的活性可保持幾個月（Nakanishi 等1969）。一些魚類蛋白質(zhì)可以用市場買來的材料進行分析，但這里的目的是區(qū)分種，而不是為了獲得詳盡的遺傳數(shù)據(jù)。 
 
 
1．2．5 用于酶和蛋白質(zhì)研究的血樣的采集 
    試驗所用的注射器、試管等應(yīng)用肝素包被（是鋰鹽），或者是用低溫保存的肝素潤濕。如果可能的話，所有溶液配制等操作均應(yīng)在5℃條件下快速完成。對于較大體積的樣品（＞5ml），將紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血漿分開。首先在1000r／min 離心10 分鐘，快速吸取血漿，迅速分裝凍存。然后吸出漂浮在紅細(xì)胞表面的一層白細(xì)胞帶，再用5～10 倍體積的PBS 將紅細(xì)胞洗兩次后離心，zui后將片狀沉淀物快速凍存。 
    白細(xì)胞層用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化銨、0．01mol／dm３ 碳酸氫鉀、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到變成澄清的紅色（約 5 分鐘）。在 500r／min 離心 5 分鐘后，小心吸去 ACK 和紅細(xì)胞碎片，剩下的白細(xì)胞會重新懸浮于 ACK 中。2 分鐘后，細(xì)胞成團沉淀，此時再用 PBS 洗。如果沉淀物仍為紅色，則將整個過程重復(fù)一次，而后將其凍存。白細(xì)胞（酶的來源）也可以通過將等分血樣鋪展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分鐘），再用巴氏吸管從界面吸取白細(xì)胞，于1000r／min 離心10 分鐘，而后凍存。用 Ficoll 分離的紅細(xì)胞很難再復(fù)原。 
    有些蛋白質(zhì)可以用其他方式保存的血樣進行分析：①保存于5℃并在幾小時內(nèi)送到實驗室的；②凍存的全血（未處理過）；③全血或經(jīng)分離的血樣稀釋于3 倍體積的苯甲醛中，并保存于室溫下。蛋白質(zhì)電泳是用于研究種群內(nèi)遺傳多樣性或分類學(xué)差異的方法。同其他脊椎動物相比，哺乳動物血樣并非是很好的酶和蛋白質(zhì)的來源，有時取軟組織更好。 
 
1．2．6 用于核DNA 研究的軟組織的保存 
    將組織切成1cm 見方的小塊，包起來凍存。或?qū)⑵浞湃霂妆扼w積的80％乙醇（分析 
純）中，于4℃下存放。兩種方法中以前一種方法更好。 
 
 
1．2．7 用于核DNA 研究的血樣的保存保存血樣可用占血樣體積0．01 倍的15％ K２EDTA 作為抗凝劑，并且能夠加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸級，Boehringer Mannheim 冰凍保存，用新解凍的），充分混合后迅速凍存。血與EDTA 混合液可在室溫下放置幾天，但DNA 的質(zhì)量不會太好。 
DNA 技術(shù)可以分析幾乎所有組織樣品基因組的任何一部分，從而能夠克服用蛋白質(zhì)研 究變異及分類學(xué)時出現(xiàn)的有關(guān)問題。 
 
1．2．8 用于制備DNA 的毛發(fā)及樣品的保存 
    雖然以前從干燥或用福爾馬林固定的毛發(fā)及樣品中提取過DNA，但zui可靠的保存方法是凍存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必須注意的一點是，盡可能地減少其他來源的DNA 對樣品的污染，特別是實驗者的手，因為PCR 反應(yīng)對微量DNA 是很敏感的。較好的做法是儀器經(jīng)烘烤（180℃過夜）或火焰消毒，其他所用的每一件東西（手套、試管、工作臺面）用一套新的、經(jīng)γ射線消毒處理的商業(yè)化產(chǎn)品。樣品也可以用來作常規(guī)的遺傳分析，如不需要人工控制交配就可進行連鎖研究（Li 等1988）。當(dāng)然，樣品還可用于人工授精，這在圈養(yǎng)動物的遺傳管理上是很重要的。 
 
 
1．2．9 用于提取線粒體DNA 的軟組織及血樣的保存 
    將樣品在4℃下保存，并盡快送到實驗室。血樣貯存于有葡萄糖檸檬酸包被的真空管中時，可以凍存幾年（在液氮中），但解凍后只能在室溫下保存幾天時間。線粒體DNA 的分析對研究物種在地理分布上的變異及構(gòu)建譜系尤其有用。 
 
1．2．10 用于提供RNA 的軟組織的保存 
    RNA 會在極短的時間內(nèi)被破壞，因此必須在動物死亡或活檢后1～2 分鐘內(nèi)迅速將其切成1cm 的小塊，并放人液氮中凍存。 
    RNA 可用于 DNA 文庫的構(gòu)建，它能為遺傳學(xué)家提供探針，用于個體總DNA 中單個活性基因的分析。雖然來源于其他動物的探針也能用，但用同種的探針效果。 
 
 
2 動物組織DNA 樣品的提取 
    目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我們在這一部分中除了介紹常規(guī)的DNA提取方法外，還將著重討論由微量樣品（如毛發(fā)）和陳舊古老樣品提取DNA 的一些新方法。 
 
2．1提取動物總DNA 的常規(guī)方法 
    從動物組織中提取DNA 的常規(guī)步驟如下： 
（1）取動物組織100mg 左右于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎。 
（2）在樣品管中加入如下試劑： 
500μl STE 溶液 
25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml） 
75μl 10％ SDS 
（3）混勻后置56℃下消化2 小時以上（隔一定時間混勻一次）。 
（4）加人等體積的飽和酚溶液，輕輕顛倒混合5 分鐘以上（用于rDNA 和RAPD 分析的樣品需抽提24 小時）。 
（5）7 000r／min 離心5 分鐘。 
（6）小心將上層清液移至另一干凈的離心管中，加入等體積的*及，并重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。 
（7）以等體積的（內(nèi)含1／25 體積的異戊醇）重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。 
（8）在上清液中加入 1／10 體積的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍體積的冷無水乙醇或1 倍體積的異丙醇，以沉淀DNA。 
（9）置—70℃下沉淀2 小時或置—20℃下沉淀過夜。 
（10）7 000r／min 離心10 分鐘，再以 70％冷乙醇洗滌DNA 沉淀一次。將沉淀置真空干燥器或37℃溫箱中干燥。 
（11）以適量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 樣品。 
（12）以分光光度計測定DNA 的濃度（260nm），260／280nm 的光密度比值應(yīng)在 1．8 以上，否則提示可能有蛋白質(zhì)或*的污染。 
（13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。 
（14）取2μl 左右的樣品進行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。 
 
2．2 微量動物組織樣品的總DNA 提取方法 
    從微量組織中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）發(fā)展起來的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一種螯合劑）提取DNA。此方法簡便、快速，提取后的DNA 樣品可以直接作為PCR 的模板。具體的操作步驟如下： 
（1）取一小塊冰凍的組織（少于1mg，可用經(jīng)消毒的槍頭鉆取），或1～3 根帶有毛根的毛發(fā)（需先經(jīng) 90％、70％的乙醇和滅菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入經(jīng)過高溫消毒的離心管中。離心管內(nèi)事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。 
（2）將樣品管在56℃下放置1 小時或更長時間，直至組織樣品成粉末狀（不同組織所需時間各不相同）。 
（3）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 
（4）在 95～100℃下煮 15～40 分鐘。 
（5）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 
（6）將樣品管在4℃下保存，進行PCR 反應(yīng)之前再次離心，使Chelex 顆粒沉淀。取上清液（1～10μl）作為DNA 模板。  
 
2．3 陳舊、古老DNA 樣品的提取方法 
    對于陳舊、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段從古埃及木乃伊中提取并測定了一段DNA 序列。然而，較為廣泛地開展對古老DNA 的研究是在多酶鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（PCR）發(fā)明以后才開始的（Mullis，F(xiàn)allona 1987）。 
    經(jīng)過一定時期的物理、化學(xué)作用（幾十年至幾百萬年）的DNA 往往存在比較嚴(yán)重的降解，DNA 段常常僅有幾百個bp 的長度，并且可能存在堿基的修飾和一些抑制PCR 反應(yīng)的物質(zhì)。因此，在從陳舊或古老樣品中提取DNA 時，zui為關(guān)鍵的問題就是防止現(xiàn)代DNA 的污染。進行DNA 提取操作的所有器皿、器械和試劑均要進行滅菌處理，提取過程應(yīng)在超凈臺中進行。此外，提取時應(yīng)設(shè)陰性對照，以監(jiān)測是否存在外源DNA 的污染。下面介紹的是一種較為簡便的提取方法。 
（1）取樣品少許（如哺乳動物的皮張可取 1cm × 1cm 見方的小塊），用剪刀、手術(shù)刀等器械對樣品表面進行處理，除去zui容易遭受外來污染的表層。對于骨骼、琥珀等堅硬的樣品則需要用小鋼鉆等特殊器械從內(nèi)部取得樣品。 
（2）經(jīng)過表面處理的樣品用90％乙醇、70％乙醇和去離子水依次進行清洗。 
（3）在滅菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去離子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 體積的（20μl）10％的β-巰琉基乙醇。處理過的樣品放入上述溶液前要盡可能剪碎。 
（4）在56℃下消化48 小時。 
（5）樣品管中加入等體積的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5～10秒鐘，然后在98℃下放置20～60 分鐘。 
（6）振蕩混合5～10 秒鐘，并使之冷卻至室溫。 
（7）12 000r／min 離心 5～10 分鐘。 
（8）小心取出上層清液，置另一干凈的管中保存。